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分子克隆袭击者

记者:365bet地址 时间:2019-08-11 08:58  来源:365bet体育备用网址
分子克隆
双载体消化和外源片段(PCR产物)
为确保足够量的连接反应,必须加入1μgDNA用于酶促裂解反应,1μl2μl酶,2μl10×缓冲液,20μl1μgDNA和水加起来。
(因此,需要运行凝胶来分析DNA和载体的浓度,需要1到2μl,并通过电泳测量内容物。
1 ul的量太低,因此除了9 ul水外,您还可以添加上样缓冲液。
6ul 15000bp,2500bp条带的制造商具有约100ng DNA的亮度。
通过比较制造商的亮度以促进连接量来计算通过消化回收的DNA浓度。
ImageJ软件可以进行灰度分析。
在完成双重消化反应后,使用PCR洗涤试剂盒回收DNA和载体。
恢复后,也分析浓度。
(DNA的浓度可以用分光光度计直接测量,但在一般的消化反应后浓度会相对较低。稀释1μl后浓度会很低)仪器的测量范围它对电泳也非常敏感,可以消除对条带,RNA,蛋白质等浓度的干扰。

第二是连接反应。
载体为100ng,根据大小确定DNA片段的大小,加入1μl缓冲液,1μlT4连接酶和水至10μl。16°在12到16小时之间。
承运人(约0。
03pmol与外源DNA的摩尔比为1:3至1:10,所需量可由载体和DNA片段的长度计算。
计算机上有一个清洁粘合剂的文件。这是一种连接反应。
根据需要填写Xls以获得连接的反应体积。
矢量大小通常为5 kb到10 kb,因此严格计算0。
03 pmol载体的质量不太重要,约100 ng。
如果时间设置,则以25°连接15分钟,然后转换为5μl,并以16°连接剩余的5μl以继续连接。
第三,将质粒转化到感受态大肠杆菌中。
从-70°提取感受态,并在将棕榈融化后立即将其插入冰中并与5μl连接产物+100μl感受态大肠杆菌混合。
在冰浴中加热30分钟,然后在90℃加热90秒。在热冲击期间不要摇动EP管。
然后立即放冰并休息2分钟。
(连接产品的数量不应超过主管国家容量的5%,因为它不值得损失,否则转换效率将降低。

将700L LB培养基加入到洁净工作台中,然后用37℃搅拌器培养45分钟至1小时。
以4000rpm离心3分钟,在干净的工作台上丢弃700μl上清液,然后将剩余的细菌溶液轻轻煮沸到板中。(电镀玻璃棒需要用酒精灯消毒然后冷却)
将37℃培养箱放置15分钟,然后倒置12-16小时。
(阳性克隆分泌酶,在培养基中水解ambisylate并水解周围的ambisylate,以便在16小时内在阳性克隆周围形成卫星集落。
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